PRESENTACIÓN .............................................................................................................................................................. 13
Parte I
FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS
DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y LA CITOGENÉTICA
1. FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR ............................................... 17
Objetivos ................................................................................................................................................................... 17
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 18
Glosario ...................................................................................................................................................................... 19
1.1. Introducción: las células procariota y eucariota ............................................................ 19
1.2. Ácidos nucleicos ................................................................................................................................. 20
1.3. ADN ............................................................................................................................................................. 23
1.4. ARN .............................................................................................................................................................. 25
1.4.1. Tipos de ARN ........................................................................................................................... 26
1.5. Propiedades físicas del ADN relacionadas con las técnicas
de biología molecular ...................................................................................................................... 27
1.6. Características funcionales del ADN ....................................................................................... 29
1.6.1. Replicación o duplicación del ADN ............................................................................... 30
1.6.2. Transcripción ............................................................................................................................ 31
1.6.3. Traducción ................................................................................................................................ 32
1.7. La información genética. La estructura de los genes .................................................. 33
1.8. Organización del genoma humano ...................................................................................... 35
6 Biología molecular y citogenética
Índice
1.9. Regulación de la expresión génica .......................................................................................... 37
1.10. Enzimas asociadas a los ácidos nucleicos ........................................................................... 38
1.11. Mutaciones y polimorfismos ....................................................................................................... 39
1.11.1. Mutaciones .............................................................................................................................. 40
1.11.2. Polimorfismos ......................................................................................................................... 41
1.12. ADN plasmídico .................................................................................................................................. 42
Resumen..................................................................................................................................................................... 42
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 43
Supuesto práctico................................................................................................................................................ 44
Lee y debate en clase ....................................................................................................................................... 44
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 45
2. FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS DE LA CITOGENÉTICA .................................................................. 49
Objetivos ................................................................................................................................................................... 49
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 50
Glosario ...................................................................................................................................................................... 51
2.1. Cromosomas: organización cromosómica y estructura .............................................. 51
2.1.1. Número de cromosomas .................................................................................................... 51
2.1.2. Leyes que cumplen los cromosomas ............................................................................. 52
2.1.3. Proteínas cromosómicas ...................................................................................................... 53
2.1.4. Estados de condensación de los cromosomas ......................................................... 53
2.1.5. Componentes de los cromosomas ................................................................................. 56
2.1.6. Tipos de cromosomas humanos ...................................................................................... 58
2.1.7. Autosomas y cromosomas sexuales ............................................................................... 58
2.1.8. Diferencia entre los cromosomas X e Y de mamíferos ............................................ 58
2.1.9. Heterocromatina y eucromatina ....................................................................................... 60
2.2. Ciclo celular ............................................................................................................................................ 61
2.2.1. Interfase ...................................................................................................................................... 62
2.2.2. Fase de división celular o fase M ..................................................................................... 62
2.3. Nomenclatura básica en genética ........................................................................................... 71
Resumen..................................................................................................................................................................... 71
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 72
Supuesto práctico................................................................................................................................................ 73
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 73
Parte II
TÉCNICAS CITOGENÉTICAS
3. ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA ..................................................................... 77
Objetivos ................................................................................................................................................................... 77
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 78
Glosario ...................................................................................................................................................................... 79
3.1. Introducción .......................................................................................................................................... 79
3.2. Organigrama ......................................................................................................................................... 79
3.3. Personal .................................................................................................................................................... 81
3.4. Personal técnico .................................................................................................................................. 81
3.4.1. Funciones del personal técnico ....................................................................................... 81
Biología molecular y citogenética 7
Índice
3.4.2. Formación del personal técnico ...................................................................................... 82
3.5. Procedimientos de laboratorio ................................................................................................. 82
3.6. Instalaciones .......................................................................................................................................... 83
3.6.1. Área técnica ............................................................................................................................. 83
3.6.2. Área de estudio de los cromosomas ............................................................................. 85
3.7. Equipos del laboratorio de citogenética ............................................................................ 86
3.7.1. Equipamiento mínimo .......................................................................................................... 86
3.7.2. Equipamiento opcional ....................................................................................................... 89
3.8. Materiales y reactivos ....................................................................................................................... 90
3.9. Medios y aditivos ................................................................................................................................ 92
3.9.1. Sistemas tampón .................................................................................................................... 93
3.9.2. Sueros y sustitutos .................................................................................................................. 93
3.9.3. Agentes mitógenos ............................................................................................................... 94
3.10. Esterilidad en el laboratorio de citogenética ................................................................... 94
3.10.1. Procedimientos que pueden originar la contaminación de los cultivos ....... 94
3.10.2. Manipulación de muestras en condiciones de esterilidad ................................. 95
3.10.3. Esterilización .......................................................................................................................... 97
3.10.4. Antibióticos y fungicidas .................................................................................................. 98
3.10.5. Fuentes de contaminación ............................................................................................... 98
3.10.6. Procedimientos en caso de contaminación .............................................................. 99
3.11. Seguridad en los laboratorios de citogenética ............................................................... 100
3.11.1. Protocolos de actuación en caso de accidente ...................................................... 102
3.12. Gestión de residuos.......................................................................................................................... 102
3.12.1. Gestión de residuos químicos ....................................................................................... 102
3.12.2. Gestión de residuos biosanitarios ............................................................................... 103
Resumen..................................................................................................................................................................... 104
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 105
Práctica 3.1 .............................................................................................................................................................. 106
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 107
4. TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS .............................................................................. 109
Objetivos ................................................................................................................................................................... 109
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 110
Glosario ...................................................................................................................................................................... 110
4.1. Introducción .......................................................................................................................................... 111
4.2. Técnicas de obtención y mantenimiento de los cultivos .......................................... 112
4.2.1. Tipos de cultivos celulares ................................................................................................. 112
4.2.2. Determinación del número y viabilidad celular ......................................................... 113
4.2.3. Muestras para análisis cromosómico .............................................................................. 113
4.3. Cultivo de linfocitos de sangre periférica para estudios
citogenéticos constitucionales .................................................................................................. 114
4.3.1. Condiciones preanalíticas de las muestras ................................................................. 115
4.3.2. Siembra de la muestra .......................................................................................................... 116
4.3.3. Técnicas de cultivos y obtención de los cromosomas............................................ 119
4.3.4. Técnicas de obtención de las extensiones................................................................... 122
4.3.5. Tinción con Giemsa ............................................................................................................... 125
4.4. Técnicas de bandeo cromosómico ......................................................................................... 126
4.4.1. Bandas GTG ............................................................................................................................. 126
4.4.2. Bandas CBG .............................................................................................................................. 127
4.4.3. Bandas NOR ............................................................................................................................ 128
8 Biología molecular y citogenética
Índice
4.5. Cultivo de linfocitos sincronizados. Cariotipo de alta resolución ....................... 130
4.6. Cultivo celular en diagnóstico prenatal ................................................................................ 131
4.6.1. Cultivo celular de fibroblastos de líquido amniótico .............................................. 131
4.6.2. Cultivo de vellosidades coriales....................................................................................... 137
4.6.3. Cultivo celular de sangre procedente del cordón umbilical fetal ...................... 139
Resumen..................................................................................................................................................................... 139
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 140
Práctica 4.1 .............................................................................................................................................................. 141
Práctica 4.2 .............................................................................................................................................................. 143
Práctica 4.3 .............................................................................................................................................................. 144
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 146
5. ANÁLISIS CROMOSÓMICO. CARIOTIPO HUMANO ....................................................................... 149
Objetivos ................................................................................................................................................................... 149
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 150
Glosario ...................................................................................................................................................................... 150
5.1. Introducción .......................................................................................................................................... 151
5.2. Clasificación de los cromosomas .............................................................................................. 151
5.3. Constitución cromosómica ........................................................................................................... 152
5.4. Identificación de los cromosomas bandeados .............................................................. 152
5.4.1. Idiograma ................................................................................................................................... 153
5.4.2. Nivel de resolución de los cromosomas ...................................................................... 154
5.4.3. Identificación de los cromosomas con bandas C y NOR ...................................... 155
5.5. Cromatina sexual ................................................................................................................................. 155
5.6. Métodos de análisis cromosómico .......................................................................................... 156
5.6.1. Análisis directo al microscopio ........................................................................................ 157
5.6.2. Equipos cariotipadores ....................................................................................................... 157
5.6.3. Localización de las metafases apropiadas para análisis ......................................... 159
5.6.4. Buscador automático de metafases ................................................................................ 159
5.6.5. Análisis cromosómico .......................................................................................................... 160
5.6.6. Artefactos y alteraciones cromosómicas originadas por el cultivo ........................ 163
5.7. Cariotipo: definición y uso ............................................................................................................ 164
5.8. Estudios de alta resolución .......................................................................................................... 164
5.9. Nomenclatura citogenética .......................................................................................................... 165
5.9.1. Fórmula cromosómica .......................................................................................................... 167
5.10. Indicaciones para estudio de cariotipos ............................................................................. 167
5.11. Polimorfismos cromosómicos que afectan a las regiones heterocromáticas .... 168
Resumen..................................................................................................................................................................... 168
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 169
Práctica 5.1 .............................................................................................................................................................. 170
Práctica 5.2 .............................................................................................................................................................. 171
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 171
6. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS.
APLICACIONES DIAGNÓSTICAS DE LAS TÉCNICAS CITOGENÉTICAS ............................... 175
Objetivos ................................................................................................................................................................... 175
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 176
Glosario ...................................................................................................................................................................... 177
6.1. Introducción .......................................................................................................................................... 177
Biología molecular y citogenética 9
Índice
6.2. Clasificación de las anomalías cromosómicas ................................................................... 178
6.3. Anomalías numéricas ........................................................................................................................ 178
6.3.1. Euploidías ................................................................................................................................. 178
6.3.2. Tetraploidía ............................................................................................................................... 179
6.3.3. Aneuploidías ............................................................................................................................ 180
6.4. Anomalías estructurales .................................................................................................................. 184
6.4.1. Translocaciones ....................................................................................................................... 185
6.4.2. Inserciones ................................................................................................................................ 187
6.4.3. Inversiones ................................................................................................................................ 187
6.4.4. Deleciones ................................................................................................................................ 188
6.4.5. Duplicaciones .......................................................................................................................... 189
6.4.6. Cromosomas en anillo .......................................................................................................... 190
6.4.7. Isocromosomas ....................................................................................................................... 191
6.4.8. Cromosomas marcadores y microcromosomas ......................................................... 191
6.5. Mosaicismos y quimeras ................................................................................................................. 192
6.6. Anomalías de los cromosomas sexuales .............................................................................. 193
6.6.1. Anomalías numéricas de los cromosomas sexuales ................................................ 193
6.6.2. Síndrome de Turner 45,X0. Disgenesia ovárica .......................................................... 194
6.6.3. Síndrome del triple-X ........................................................................................................... 195
6.6.4. Mujeres 48,XXXX y mujeres 49,XXXXX .......................................................................... 195
6.6.5. Síndrome de Klinefelter ....................................................................................................... 196
6.6.6. Síndrome de Fracaro 49,XXXXY ....................................................................................... 196
6.6.7. Síndrome 47,XYY .................................................................................................................... 196
6.6.8. Anomalías estructurales de los cromosomas sexuales ............................................ 197
6.7. Nomenclatura cromosómica de las alteraciones cromosómicas ......................... 198
6.8. Aplicaciones diagnósticas de las técnicas citogenéticas .......................................... 199
Resumen..................................................................................................................................................................... 199
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 200
Supuesto práctico................................................................................................................................................ 202
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 202
Parte III
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DEL ADN Y DE LA CITOGENÉTICA MOLECULAR
7. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS ....................................................... 207
Objetivos ................................................................................................................................................................... 207
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 208
Glosario ...................................................................................................................................................................... 209
7.1. Introducción .......................................................................................................................................... 209
7.2. Técnica de hibridación de los ácidos nucleicos ............................................................. 209
7.2.1. Sondas ........................................................................................................................................ 211
7.2.2. Métodos de marcaje de las sondas ................................................................................ 211
7.2.3. Procedimiento de hibridación .......................................................................................... 215
7.3. Hibridación in situ ............................................................................................................................. 217
7.4. Hibridación fluorescente in situ (FISH).................................................................................. 218
7.4.1. Tipos de sondas utilizadas en FISH convencional .................................................... 219
7.4.2. Técnicas derivadas de la FISH convencional ............................................................... 222
7.4.3. Protocolo de la técnica de FISH ....................................................................................... 224
7.4.4. Aplicaciones, ventajas y limitaciones de las técnicas de FISH ............................ 226
10 Biología molecular y citogenética
Índice
7.5. Técnicas de hibridación y transferencia de ácidos nucleicos
en soporte sólido ............................................................................................................................... 227
7.5.1. Hibridación genómica comparada ................................................................................. 227
7.5.2. Array-CGH ................................................................................................................................ 229
7.5.3. Southern blot .......................................................................................................................... 233
7.5.4. Northern blot ........................................................................................................................... 234
7.5.5. Técnicas de dot blot, sus variantes y la técnica de captura de híbrido ........... 235
7.6. FICTION ..................................................................................................................................................... 239
Resumen..................................................................................................................................................................... 239
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 240
Supuestos prácticos........................................................................................................................................... 241
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 241
Parte IV
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
8. ORGANIZACIÓN DE LOS LABORATORIOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ........................... 247
Objetivos ................................................................................................................................................................... 247
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 248
Glosario ...................................................................................................................................................................... 248
8.1. Introducción .......................................................................................................................................... 249
8.2. Organización y funciones del laboratorio de biología molecular ....................... 249
8.2.1. Personal ...................................................................................................................................... 250
8.2.2. Procesos que se realizan y personal encargado ....................................................... 252
8.3. Equipamiento ........................................................................................................................................ 253
8.4. Materiales y reactivos ..................................................................................................................... 254
8.5. Áreas de trabajo, tareas y equipos ......................................................................................... 255
8.5.1. Área de preamplificación pre-PCR .................................................................................. 255
8.5.2. Área de amplificación. Termocicladores convencionales y de gradiente, y
para PCR cuantitativa a tiempo real ................................................................................. 256
8.5.3. Área de post-amplificación o análisis ............................................................................ 257
8.5.4. Área neutra ................................................................................................................................ 258
8.6. Normas de trabajo en el laboratorio de biología molecular .................................. 259
8.6.1. Normas específicas del laboratorio de biología molecular .................................. 260
8.6.2. Normas en la utilización de los equipos ...................................................................... 261
8.7. Fuentes de contaminación ........................................................................................................... 262
8.8. Seguridad ................................................................................................................................................. 262
8.8.1. Riesgo debido a la exposición a agentes físicos ....................................................... 263
8.8.2. Riesgo debido a la exposición a agentes químicos ................................................. 263
8.8.3. Riesgo debido a la exposición a agentes biológicos .............................................. 265
8.8.4. Normas de seguridad generales referidas a la forma de trabajo ....................... 266
8.8.5. Señalización de los riesgos ................................................................................................ 267
8.9. Gestión de residuos.......................................................................................................................... 268
8.10. Calidad y uso eficiente de los recursos .............................................................................. 269
8.10.1. Equipos y utensilios ............................................................................................................ 269
8.10.2. Materiales y productos ...................................................................................................... 269
8.10.3. Productos químicos de desinfección y limpieza ................................................... 270
8.10.4. Agua .......................................................................................................................................... 270
8.10.5. Papel ......................................................................................................................................... 271
8.10.6. Energía ...................................................................................................................................... 271
Biología molecular y citogenética 11
Índice
Resumen..................................................................................................................................................................... 272
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 272
Práctica 8.1 .............................................................................................................................................................. 273
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 275
9. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. PCR Y ELECTROFORESIS ......... 277
Objetivos ................................................................................................................................................................... 277
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 278
Glosario ...................................................................................................................................................................... 278
9.1. Introducción .......................................................................................................................................... 279
9.2. Técnicas de extracción de ADN/ARN en sangre periférica, biopsias y tejidos .. 279
9.2.1. Muestras ..................................................................................................................................... 279
9.2.2. Fundamento de las técnicas de extracción ................................................................. 280
9.2.3. Técnicas manuales de extracción del ADN ................................................................. 282
9.2.4. Kits de extracción del ADN ................................................................................................ 284
9.2.5. Sistemas automáticos de extracción de ácidos nucleicos .................................... 286
9.2.6. Técnicas de extracción de ARN ....................................................................................... 287
9.3. Cuantificación y calidad del ADN/ARN extraído .............................................................. 290
9.4. PCR ............................................................................................................................................................... 292
9.4.1. Componentes para la realización de la PCR ................................................................ 293
9.4.2. Etapas de la PCR ...................................................................................................................... 294
9.4.3. Purificación del producto de PCR .................................................................................... 296
9.4.4. Problemas que se pueden presentar en la PCR .......................................................... 298
9.5. Técnicas variantes de la PCR ......................................................................................................... 299
9.5.1. Nested PCR o PCR anidada ................................................................................................. 299
9.5.2. Multiplex PCR ........................................................................................................................... 300
9.5.3. PCR a tiempo real o PCR cuantitativa ............................................................................... 300
9.5.4. Técnica del MLPA ................................................................................................................... 302
9.5.5. Técnica de PCR con transcripción inversa (RT-PCR) ................................................... 304
9.6. Electroforesis de ADN ...................................................................................................................... 304
9.6.1. Electroforesis capilar ............................................................................................................. 308
Resumen..................................................................................................................................................................... 309
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 309
Práctica 9.1 .............................................................................................................................................................. 310
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 311
10. MÉTODOS DE CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL ADN ........................................................ 315
Objetivos ................................................................................................................................................................... 315
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 316
Glosario ...................................................................................................................................................................... 316
10.1. Introducción .......................................................................................................................................... 317
10.2. Clonación del ADN ........................................................................................................................... 317
10.2.1. Tipos de clonación y fases del procedimiento de clonación ............................ 317
10.3. Secuenciación de ADN ................................................................................................................... 323
10.3.1. Método de secuenciación de Maxam y Gilbert ....................................................... 324
10.3.2. Método de secuenciación de Sanger y Coulson ..................................................... 325
10.3.3. Secuenciación automática de primera generación ................................................. 327
10.3.4. Otros análisis realizados con el secuenciador: análisis de fragmentos ........... 328
10.4. Secuenciación de última generación o secuenciación masiva o NGS ............. 329
12 Biología molecular y citogenética
Índice
10.4.1. Sistemas de clonación del ADN para secuenciación ............................................. 330
10.4.2. Reacciones de secuenciación .......................................................................................... 332
10.5. Secuenciación de 3.ª generación ............................................................................................ 334
10.5.1. Secuenciación Ion Torrent ................................................................................................. 335
10.5.2. Secuenciación por nanoporos ........................................................................................ 335
10.5.3. Análisis de los datos obtenidos por secuenciación masiva ................................ 336
10.6. Secuenciación de ARN .................................................................................................................... 337
10.7. Bioinformática: análisis de bases de datos de ADN y proteínas ........................... 337
10.7.1. Bases de datos ....................................................................................................................... 338
Resumen..................................................................................................................................................................... 340
Ejercicios propuestos........................................................................................................................................ 341
Supuesto práctico................................................................................................................................................ 342
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 342
11. APLICACIÓN CLÍNICA DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ............................... 345
Objetivos ................................................................................................................................................................... 345
Mapa conceptual ................................................................................................................................................. 346
Glosario ...................................................................................................................................................................... 346
11.1. Aplicaciones de los estudios genéticos en el diagnóstico clínico ..................... 347
11.2. Aplicación de los estudios genéticos .................................................................................... 347
11.2.1. Consideraciones en los estudios genéticos ............................................................... 349
11.3. Aplicaciones en el diagnóstico posnatal ........................................................................... 350
11.3.1. Aplicaciones en neonatología y pediatría .................................................................. 350
11.3.2. Aplicaciones en endocrinología ..................................................................................... 353
11.3.3. Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas ........ 355
11.3.4. Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares .............. 356
11.3.5. Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades metabólicas ....................... 357
11.3.6. Aplicaciones en el diagnóstico de infertilidad ....................................................... 358
11.4. Aplicaciones en el diagnóstico prenatal ............................................................................. 360
11.4.1. Diagnóstico prenatal invasivo ........................................................................................... 361
11.4.2. Diagnóstico prenatal no invasivo .................................................................................... 362
11.4.3. Aplicaciones en el diagnóstico preimplantacional ................................................. 363
11.5. Aplicaciones en el diagnóstico molecular microbiológico .................................... 364
11.6. Aplicaciones en medicina legal y forense ........................................................................... 366
11.7. Aplicaciones en farmacogenómica ......................................................................................... 368
11.8. Genética y cáncer .............................................................................................................................. 369
11.8.1. Mecanismos de transformación de células normales en células tumorales .. 369
11.8.2. Tipos de cáncer ..................................................................................................................... 372
11.8.3. Oncohematología ................................................................................................................. 375
Resumen..................................................................................................................................................................... 377
Ejercicios propuestos ....................................................................................................................................... 377
Supuestos prácticos........................................................................................................................................... 378
Test de autoevaluación..................................................................................................................................... 378
Anexo 7.1. Hibridación in situ cromogénica (CISH) ............................................................................. 381
Anexo 9.1. Pretratamiento de diferentes muestras biológicas previo a la extracción
de los ácidos nucleicos ............................................................................................................................. 383
Anexo 9.2. Métodos de detección de la hibridación de la fluorescencia en la técnica
de PCR a tiempo real ................................................................................................................................... 387
Anexo 10.1. Plataformas de secuenciación: Illumina y SOLID ........................................................ 391