PRÓLOGO.................................................................................................................................................................... 15
1.. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE GENÉTICA.......................................................... 17
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 17
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 17
1.1.. Equipamiento....................................................................................................................................... 17
1.2.. Organización ........................................................................................................................................ 19
1.3.. Seguridad ............................................................................................................................................... 20
1.4.. Diseño de los experimentos.......................................................................................................... 21
2.. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS...................................................................................... 23
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 23
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 23
2.1.. Fundamento teórico .......................................................................................................................... 23
2.2.. Extracción de ADN genómico..................................................................................................... 24
2.2.1.. Lisis celular........................................................................................................................ 24
2.2.2.. Eliminación de restos celulares................................................................................. 25
2.2.3.. Extracción del ADN........................................................................................................ 26
2.2.4.. Precipitación del ADN................................................................................................... 30
2.2.5.. Purificación del ADN..................................................................................................... 31
2.2.6.. Elución del ADN............................................................................................................... 31
2.3.. Extracción de ADN plasmídico................................................................................................... 32
2.4.. Extracción de ARN total................................................................................................................. 33
2.4.1.. Métodos orgánicos - TRIzol........................................................................................ 33
6 Técnicas de Genética
2.4.2.. Métodos sobre soporte físico...................................................................................... 34
2.5.. Extracción de ARN mensajero..................................................................................................... 34
2.6.. Concentración y pureza de los ácidos nucleicos................................................................. 35
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 36
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 36
3.. ELECTROFORESIS E HIBRIDACIÓN .............................................................................................. 39
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 39
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 39
3.1.. Fundamento teórico .......................................................................................................................... 40
3.2.. Geles de electroforesis..................................................................................................................... 41
3.2.1.. Geles de agarosa.............................................................................................................. 41
3.2.2.. Geles de poliacrilamida................................................................................................ 43
3.2.3.. Carga de las muestras, electroforesis y lectura de resultados................... 45
3.3.. Purificación de bandas..................................................................................................................... 47
3.3.1.. A partir de un gel de agarosa..................................................................................... 48
3.3.2.. A partir de un gel de poliacrilamida....................................................................... 49
3.4.. Southern blot........................................................................................................................................ 50
3.5.. Northern blot........................................................................................................................................ 52
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 54
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 55
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 57
4.. REACCIONES EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).................................................. 59
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 59
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 59
4.1.. Fundamento teórico .......................................................................................................................... 60
4.2.. Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR)............ 64
4.3.. Reacción en cadena de la polimerasa anidada (nested polymerase Chain Reaction, PCR).............................................................................................................................................. 66
4.4.. Reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscriptasa (Retrotranscriptase
Polymerase Chain Reaction, RT-PCR).................................................................................... 68
4.4.1.. Retrotranscripción con síntesis de la primera hebra...................................... 68
4.4.2.. Retrotranscripción con síntesis de la segunda hebra..................................... 69
4.5.. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa (Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)................................................................................... 70
4.5.1.. Cuantificación absoluta usando un agente colorante de ADN de doble
cadena y una curva patrón.......................................................................................... 70
4.5.2.. Cuantificación relativa por unidad de masa usando un agente colorante de ADN de doble cadena.................................................................................. 72
4.5.3.. Cuantificación relativa usando sondas y un gen de control interno........ 72
Índice 7
4.6.. Limitaciones y aplicaciones de estas técnicas...................................................................... 73
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 76
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 76
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 78
5.. GENERACIÓN DE VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN ................................. 81
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 81
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 81
5.1.. Fundamento teórico .......................................................................................................................... 82
5.2.. Enzimas de restricción..................................................................................................................... 82
5.3.. Ligación.................................................................................................................................................. 84
5.4.. Tipos de vectores de clonación y de expresión.................................................................... 85
5.4.1.. Plásmidos............................................................................................................................. 87
5.4.2.. Bacteriófagos..................................................................................................................... 87
5.4.3.. Cósmidos.............................................................................................................................. 87
5.4.4.. Cromosomas artificiales............................................................................................... 87
5.5.. Transferencia del vector.................................................................................................................. 88
5.5.1.. Transformación de bacterias con plásmidos...................................................... 88
5.5.2.. Transducción de bacterias mediante bacteriófagos........................................ 90
5.5.3.. Transfección de células de mamífero con lipofectamina .............................. 92
5.5.4.. Transducción de células humanas mediante virus........................................... 93
5.6.. Aplicaciones......................................................................................................................................... 96
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 98
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 99
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 101
6.. INGENIERÍA GENÉTICA.......................................................................................................................... 103
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 103
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 103
6.1.. Fundamento teórico .......................................................................................................................... 104
6.2.. Knock-out / knock-in......................................................................................................................... 105
6.2.1.. Protocolo de generación de knock-out mediante agentes químicos o
físicos..................................................................................................................................... 105
6.2.2.. Protocolo de generación de knock-out / knock-in mediante inserción
de transposones................................................................................................................. 105
6.2.3.. Protocolo de generación de knock-out / knock-in basado en la recombinación homóloga.......................................................................................................... 109
6.2.4.. Protocolo de generación de knock-out / knock-in mediante recombineering................................................................................................................................... 110
6.2.5.. Protocolo de generación de knock-out mediante ZFN y TALEN.............. 112
6.3.. Knock-down.......................................................................................................................................... 112
8 Técnicas de Genética
6.3.1.. Sistemas de reducción permanente.......................................................................... 113
6.3.2.. Sistemas de reducción temporal................................................................................ 113
6.4.. Recombinación Cre-LoxP.............................................................................................................. 114
6.5.. Sistemas CRISPR-Cas9 .................................................................................................................. 116
6.5.1.. Knock-out/ knock-in generado mediante técnicas CRISPR-Cas9........... 116
6.5.2.. CRISPRa y CRISPRi....................................................................................................... 117
6.5.3.. Edición de nucleótidos mediante CRISPR........................................................... 119
6.6.. Aplicaciones de estas técnicas..................................................................................................... 120
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 121
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 122
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 123
7.. MATERIAL UTILIZADO PARA ESTUDIOS CITOGENÉTICOS........................................ 125
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 125
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 125
7.1.. Material utilizado para el estudio de la mitosis................................................................... 126
7.1.1.. Obtención del material de forma directa.............................................................. 126
7.1.2.. Obtención del material mediante cultivos celulares....................................... 129
7.2.. Material utilizado para el estudio de la meiosis.................................................................. 131
7.2.1.. Material para el estudio de la meiosis masculina............................................ 131
7.2.2.. Material para el estudio de la meiosis femenina.............................................. 132
7.3.. Técnicas de aislamiento cromosómico .................................................................................... 133
7.3.1.. Microdisección cromosómica..................................................................................... 133
7.3.2.. Citometría de flujo........................................................................................................... 134
7.4.. Preparaciones cromosómicas....................................................................................................... 135
7.4.1.. Preparaciones por aplastamiento (squash)......................................................... 135
7.4.2.. Preparaciones por extensión (spreading)............................................................. 136
7.5.. Diferencias entre las preparaciones de plantas y animales............................................. 138
7.6.. Los cromosomas de hongos y levaduras................................................................................. 139
7.7.. El caso concreto de los cromosomas humanos.................................................................... 140
7.7.1.. Diagnóstico preimplantacional................................................................................. 141
7.7.2.. Diagnóstico prenatal utilizando biopsia de corion.......................................... 141
7.7.3.. Diagnóstico prenatal mediante amniocentesis.................................................. 141
7.7.4.. Diagnóstico prenatal no invasivo utilizando sangre materna.................... 141
7.8.. Tinción de los cromosomas. Métodos convencionales.................................................... 141
7.9.. Tinción de Feulgen............................................................................................................................ 143
7.10.. Observación al microscopio y obtención de imágenes.................................................... 144
7.11.. Cariotipo e idiograma. Ejemplo del cariotipo humano.................................................... 145
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 147
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 148
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 149
Índice 9
8.. TÉCNICAS DE BANDEO CROMOSÓMICO ................................................................................. 151
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 151
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 151
8.1.. Fundamento teórico .......................................................................................................................... 152
8.2.. Técnicas para la observación de bandas cromosómicas.................................................. 152
8.2.1.. Bandas C.............................................................................................................................. 152
8.2.2.. Bandas G.............................................................................................................................. 153
8.2.3.. Bandas R.............................................................................................................................. 154
8.2.4.. Bandas NOR o de impregnación argéntica ......................................................... 154
8.2.5.. Bandeo de restricción .................................................................................................... 155
8.2.6.. Técnicas de bandeo mediante fluorescencia....................................................... 156
8.3.. Bandeo por incorporación de BrdU .......................................................................................... 160
8.4.. Bandeos de alta resolución............................................................................................................ 160
8.5.. Significado de las bandas cromosómicas................................................................................ 161
8.6.. Aplicaciones y limitaciones de estas técnicas...................................................................... 162
8.6.1.. Aplicaciones....................................................................................................................... 162
8.6.2.. Limitaciones....................................................................................................................... 162
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 163
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 163
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 164
9.. TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR: HIBRIDACIÓN IN SITU.............. 167
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 167
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 167
9.1.. Fundamento teórico .......................................................................................................................... 168
9.2.. Fijación del material y preparaciones....................................................................................... 168
9.2.1.. Preparación de las sondas y marcaje..................................................................... 168
9.2.2.. Preparación y pretratamiento de los cromosomas. Diferencias entre el
material animal y vegetal............................................................................................. 171
9.3.. Protocolo de hibridación in situ fluorescente (FISH) ....................................................... 172
9.4.. Protocolo de la hibridación in situ fluorescente mediante detección con anticuerpos.................................................................................................................................................... 175
9.5.. Tipos de hibridación in situ fluorescente y sus aplicaciones......................................... 177
9.5.1.. Pintado de todo el cromosoma o Pintado Cromosómico (WCP, por sus
siglas en inglés)................................................................................................................ 177
9.5.2.. FISH Multicolor (M-FISH)......................................................................................... 178
9.5.3.. Hibridación Genómica in situ (GISH).................................................................. 178
9.5.4.. Marcado de cebadores (primers) in situ (PRINS)............................................ 179
9.5.5.. Hibridación in situ de fibra extendida (Fiber FISH)....................................... 179
9.5.6.. Hibridación Genómica Comparada (CGH)........................................................ 179
10 Técnicas de Genética
9.5.7.. FISH para detectar roturas en el ADN (DBD-FISH: DNA-breakage
detection-FISH) ................................................................................................................ 179
9.5.8.. FISH mediante Cas9 (CASFISH)............................................................................. 180
9.5.9.. FISH con ARN (RNA- FISH)...................................................................................... 180
9.6.. Limitaciones de la hibridación in situ ...................................................................................... 180
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 181
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 182
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 182
10.. TÉCNICAS DE INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS ...................................................... 185
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 185
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 185
10.1.. Fundamento teórico .......................................................................................................................... 186
10.2.. Fijación del material y preparaciones....................................................................................... 186
10.2.1.. Para la visualización sobre cromosomas............................................................. 187
10.2.2.. Visualización sobre tejidos.......................................................................................... 188
10.3.. Inmunofluorescencia directa (IFD) e indirecta (IFI)......................................................... 192
10.3.1.. Inmunofluorescencia directa (IFD)......................................................................... 193
10.3.2.. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)....................................................................... 194
10.4.. Detección enzimática: Inmunocitoquímica (ICC) e inmunohistoquímica (IHC) 197
10.4.1.. Detección enzimática directa ..................................................................................... 198
10.4.2.. Detección enzimática indirecta................................................................................. 199
10.5.. Otros métodos de inmunodetección.......................................................................................... 202
10.5.1.. Detección con avidina o espreptoavidina marcada con peroxidasa ....... 202
10.5.2.. Detección indirecta con polímeros conjugados................................................. 202
10.5.3.. Inmunodetección mediante marcaje con oro coloidal.................................... 203
10.5.4.. Técnica doble de inmunofluorescencia y FISH.................................................. 203
10.6.. Aplicaciones y limitaciones de las técnicas de inmunodetección............................... 203
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 204
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 205
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 206
11.. LA REVOLUCIÓN GENÓMICA............................................................................................................ 209
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 209
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 209
11.1.. Proyectos genómicos........................................................................................................................ 209
11.1.1.. Proyecto Genoma Humano ......................................................................................... 210
11.1.2.. Proyecto HapMap............................................................................................................ 212
11.1.3.. Proyecto 1 000 genomas............................................................................................... 213
11.1.4.. Proyecto GTEx .................................................................................................................. 215
11.1.5.. Proyecto Roadmap Epigenomics.............................................................................. 216
Índice 11
11.1.6.. Proyecto ENCODE ......................................................................................................... 217
11.2.. Organización y estructura de los genomas............................................................................. 217
11.2.1.. Arquitectura funcional del genoma......................................................................... 218
11.2.2.. Variabilidad genética..................................................................................................... 219
11.2.3.. Desequilibrio de ligamiento y bloques haplotípicos....................................... 220
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 222
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 223
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 224
12.. SECUENCIACIÓN DE ADN..................................................................................................................... 227
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 227
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 227
12.1.. Contexto histórico de los métodos de secuenciación del ADN.................................... 227
12.2.. Método Sanger con marcado fluorescente ............................................................................. 229
12.2.1.. Preparación de la muestra .......................................................................................... 229
12.2.2.. Reacción de secuenciación.......................................................................................... 230
12.2.3. Purificación del producto de la reacción de secuenciación ........................ 233
12.2.4.. Electroforesis capilar y obtención de la secuencia.......................................... 233
12.3.. Chips de ADN...................................................................................................................................... 234
12.4.. Librerías de secuenciación............................................................................................................. 236
12.4.1.. Secuenciación dirigida.................................................................................................. 237
12.4.2.. Secuenciación del exoma completo (WES) y del genoma completo
(WGS).................................................................................................................................... 238
12.4.3.. Secuenciación del transcriptoma completo (RNA-seq)................................. 239
12.4.4.. Secuenciación con bisulfito......................................................................................... 242
12.5.. Plataformas de secuenciación ...................................................................................................... 244
12.5.1.. Tecnología 454 .................................................................................................................. 244
12.5.2.. Secuenciación SOLID.................................................................................................... 245
12.5.3.. Secuenciación Ion Torrent........................................................................................... 245
12.5.4.. Secuenciación por síntesis de Illumina ................................................................. 246
12.5.5.. Secuenciación de nanoporos ..................................................................................... 246
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 247
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 248
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 250
13.. TÉCNICAS DE GENOTIPADO MASIVO......................................................................................... 253
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 253
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 253
13.1.. Estudios de asociación a gran escala ........................................................................................ 253
13.2.. Plataformas de genotipado de alto rendimiento .................................................................. 255
13.2.1.. Plataformas GWAS.......................................................................................................... 256
12 Técnicas de Genética
13.2.2.. Plataformas personalizadas....................................................................................... 258
13.3.. Tratamiento y análisis de datos................................................................................................... 260
13.3.1.. Controles de calidad....................................................................................................... 260
13.3.2.. Imputación de genotipos............................................................................................... 262
13.3.3.. Tests de asociación genética....................................................................................... 263
13.3.4.. Representación e interpretación de los resultados........................................... 265
13.4.. Anotación de variantes asociadas............................................................................................... 267
13.4.1.. Identificación de variantes genéticas altamente ligadas a la variante
asociada (proxies)........................................................................................................... 267
13.4.2.. Contexto genómico de las variantes analizadas............................................... 267
13.4.3.. Evaluación de efectos sobre la secuencia de proteínas................................. 268
13.4.4.. Evaluación de efectos sobre el splicing................................................................. 268
13.4.5.. Evaluación de anotaciones del genoma no codificante................................. 268
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 270
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 271
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 273
14.. GENÓMICA FUNCIONAL........................................................................................................................ 275
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 275
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 275
14.1.. Métodos de estudio de la accesibilidad a la cromatina .................................................... 275
14.1.1.. DNase-seq............................................................................................................................ 276
14.1.2.. FAIRE-seq............................................................................................................................ 278
14.1.3.. ATAC-seq.............................................................................................................................. 280
14.2.. Métodos de estudio de interacción de proteínas con la cromatina ............................. 281
14.2.1.. ChIP-chip............................................................................................................................. 281
14.2.2.. ChIP-seq............................................................................................................................... 282
14.3.. Métodos de estudio de la conformación de la cromatina................................................ 284
14.3.1.. Métodos tradicionales................................................................................................... 284
14.3.2.. Métodos basados en inmunoprecipitación de la cromatina ........................ 289
14.3.3.. Métodos de enriquecimiento de secuencias........................................................ 291
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 292
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 293
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 295
15.. GENÓMICA COMPARATIVA ................................................................................................................. 297
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 297
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 297
15.1.. Historia de la genómica comparativa ....................................................................................... 298
15.2.. Secuenciación de novo y ensamblaje de genomas............................................................. 299
15.3.. Anotación de ensamblajes de novo............................................................................................ 302
Índice 13
15.3.1.. Anotación estructural..................................................................................................... 303
15.3.2.. Anotación funcional........................................................................................................ 303
15.4.. Comparación de secuencias entre distintos organismos.................................................. 304
15.4.1.. Bases de datos................................................................................................................... 304
15.4.2.. Aproximaciones en los estudios de genómica comparativa......................... 305
15.5.. Filogenias moleculares.................................................................................................................... 306
15.5.1.. Árboles filogenéticos...................................................................................................... 307
15.5.2.. Métodos de análisis filogenético............................................................................... 309
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 314
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 315
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 317
16.. MEDICINA GENÓMICA............................................................................................................................ 319
Conceptos por estudiar................................................................................................................................... 319
Objetivos para el aprendizaje ...................................................................................................................... 319
16.1.. Potencial de la medicina genómica en la práctica clínica............................................... 319
16.2.. Herramientas genéticas para el diagnóstico y el pronóstico.......................................... 320
16.2.1.. Pruebas genéticas para rasgos monogénicos.................................................... 321
16.2.2.. Estrategias para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades complejas............................................................................................................................................ 323
16.3.. Farmacogenómica.............................................................................................................................. 326
16.4.. Terapia génica...................................................................................................................................... 328
16.4.1.. Vectores virales................................................................................................................. 328
16.4.2.. Vectores no virales........................................................................................................... 329
16.4.3.. Herramientas de edición del genoma..................................................................... 330
Resumen conceptual........................................................................................................................................ 331
Problemas propuestos..................................................................................................................................... 332
Preguntas de evaluación................................................................................................................................. 333
SOLUCIONARIO..................................................................................................................................................... 335
ABREVIATURAS..................................................................................................................................................... 353
REACTIVOS Y TAMPONES ............................................................................................................................. 359
BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................................................................ 363