PRÓLOGO.................................................................................................................................................................... 11
1. AISLAMIENTO Y ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS...................................................... 13
1.1.. Purificación de plásmidos por miniprep.................................................................................. 13
1.2.. Cálculo de la concentración de DNA....................................................................................... 14
1.3.. Análisis de espectros de muestras de DNA........................................................................... 15
1.4.. El genoma de una levadura ........................................................................................................... 17
1.5.. Extracción de RNA de un paciente............................................................................................ 18
1.6.. Identificación de los patrones de digestión de dos plásmidos....................................... 18
1.7.. Digestión de un fragmento lineal de DNA ............................................................................ 20
1.8.. Efecto del calentamiento en la absorción de muestras de DNA.................................. 21
1.9.. Identificación de tres geles con ácidos nucleicos................................................................ 21
1.10.. Identificación de plásmidos pBluescript ................................................................................. 23
2.. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.................................................. 25
2.1.. Hibridación de secuencias en colony blot .............................................................................. 25
2.2. Colony blot en muestras de pacientes....................................................................................... 27
2.3.. Expresión diferencial de cinco genes en tres pacientes................................................... 28
2.4.. Identificación de la posición de dos genes por Northern blot....................................... 30
2.5.. Detección de mRNA y proteína en células transfectadas............................................... 32
2.6.. El DNA fingerprinting en las pruebas de paternidad........................................................ 34
2.7. Southern blot en DNA de muestras de sangre de pacientes........................................... 34
2.8.. Concentración de una sonda marcada con digoxigenina................................................. 35
2.9.. Marcaje de un amplicón con digoxigenina............................................................................ 36
2.10.. Localización de un elemento transponible en Drosophila ............................................. 37
2.11.. Construcción de una minigenoteca e identificación de un gen de interés............... 40
6 142 problemas de Ingeniería Genética resueltos paso a paso
3. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN................................................................................................................ 43
3.1.. Digestiones simples y dobles....................................................................................................... 44
3.2.. Análisis de los cortes realizados por endonucleasas......................................................... 45
3.3.. Isosquizómeros y neosquizómeros............................................................................................ 46
3.4.. Digestiones que producen extremos religantes.................................................................... 46
3.5.. El proceso de metilación en E. coli........................................................................................... 47
3.6.. Análisis del mapa del plásmido pCB025................................................................................ 48
3.7.. Transferencia de un plásmido de E. coli a Klebsiella....................................................... 54
3.8.. El sistema de restricción/modificación en bacterias.......................................................... 54
3.9.. Caracterización de la endonucleasa de restricción Dpn I................................................ 55
3.10.. Caracterización del plásmido GSK120.................................................................................... 56
3.11.. Mapa de restricción de un DNA de 10 kb .............................................................................. 62
3.12.. Digestión de un inserto y su ligación en un vector de expresión ................................ 63
3.13.. Mapa de un plásmido pBluescript con un inserto en su polylinker............................ 66
3.14.. Análisis de un fragmento de DNA bacteriano...................................................................... 70
3.15.. Caracterización de un cósmido.................................................................................................... 75
3.16.. Ejercicio propuesto............................................................................................................................ 83
3.17.. Ejercicio propuesto............................................................................................................................ 84
4. ENZIMAS MODIFICADORAS DEL DNA. LA LIGACIÓN................................................... 87
4.1.. Caracterización de algunas enzimas modificadoras del DNA...................................... 87
4.2.. La fosfatasa alcalina y la T4 DNA ligasa ............................................................................... 91
4.3.. Ligación en un sitio EcoR V......................................................................................................... 93
4.4.. Análisis de intrones y exones....................................................................................................... 93
4.5.. Diversos tratamientos de un dsDNA ........................................................................................ 94
4.6.. Creación de un adaptador BamH I/Pst I.................................................................................. 97
4.7.. Ligación de dos fragmentos de DNA....................................................................................... 99
4.8.. Digestión y ligación de dos fragmentos de DNA............................................................... 100
4.9.. Las topoisomerasas........................................................................................................................... 104
4.10.. Ligación de un cDNA en un plásmido..................................................................................... 106
4.11.. Ligación de dos extremos protuberantes 5 compatibles................................................. 108
4.12.. Ligación de dos extremos protuberantes (overhangs) 5 compatibles...................... 110
5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y SUS APLICACIONES 115
5.1.. DNA polimerasas que pueden usarse para realizar una PCR........................................ 115
5.2.. Diseño de primers (cebadores) para una PCR ..................................................................... 116
5.3.. Diseño de primers que introducen palíndromos.................................................................. 117
5.4.. Diseño de oligonucleótidos con secuencias palindrómicas........................................... 119
5.5.. Análisis por PCR de muestras de niños infectados por VIH-1 .................................... 119
5.6.. Caracterización de una variante de la enfermedad de Parkinson................................ 121
5.7.. Introducción de una mutación puntual..................................................................................... 122
Índice 7
5.8.. El gen del Factor Neurotrófico Derivado de Cerebro (BDNF).................................... 125
5.9.. Preparación de tres mutantes de deleción progresivos por PCR................................. 126
5.10.. Identificación de bases de secuencia desconocida por PCR.......................................... 128
5.11.. PCR del gen de la -sarcoglicanopatía..................................................................................... 130
5.12.. Purificaciones de material genético........................................................................................... 133
5.13.. RT-PCR a partir del RNA total de una levadura.................................................................. 134
5.14.. Obtención de una sonda de DNA por PCR............................................................................ 136
5.15.. Amplificación del gen LacZ y su promotor........................................................................... 138
5.16.. PCR múltiple (multiplex PCR).................................................................................................... 142
5.17.. Clonación de una región cromosómica ................................................................................... 144
5.18.. Purificaciones de material genético........................................................................................... 146
6.. VECTORES PLASMÍDICOS Y OBTENCIÓN DEL DNA RECOMBINANTE............. 149
6.1.. Clonaje del gen de la calmodulina............................................................................................. 150
6.2.. Oligonucleótidos fosforilados o no fosforilados en la formación de DNA recombinante............................................................................................................................................ 152
6.3.. Cálculo del número de bacterias competentes que se van a alicuotar ...................... 153
6.4.. Cálculo de la eficacia de transformación................................................................................ 156
6.5.. Transformación de plásmidos metilados y no metilados................................................ 157
6.6.. Bacterias electrocompetentes o químicamente competentes......................................... 158
6.7.. Eficacia de la transformación de una cepa de Bacillus cereus..................................... 159
6.8.. Transformación bacteriana ............................................................................................................ 160
6.9.. Caracterización de dos vectores recombinantes.................................................................. 161
6.10.. Clonaje de los genes A y B............................................................................................................ 162
6.11.. Ligación independiente de DNA-ligasa .................................................................................. 164
6.12.. Elección del vector adecuado para subclonar un DNA pasajero................................. 166
6.13.. Clonaje en el vector de células de mamífero pCA............................................................. 169
6.14.. Clonaje de un plásmido con dos resistencias a antibióticos.......................................... 171
6.15.. Clonaje de una proteína que confiere resistencia frente a una toxina ....................... 174
6.16.. Ligación de un inserto en pBR322 y en pUC19.................................................................. 175
6.17.. El genoma de una bacteria del Amazonas.............................................................................. 177
6.18.. Fenotipos mostrados por un plásmido sometido a digestiones.................................... 178
6.19.. Introducción del gen de la -tubulina en un plásmido bacteriano.............................. 180
6.20.. Mutación del represor PrA ............................................................................................................ 180
7. VECTORES DE EXPRESIÓN.................................................................................................................. 183
7.1.. Creación de una genoteca de complementación de Rhodococcus.............................. 184
7.2.. Genoteca de complementación.................................................................................................... 185
7.3.. Sobreexpresión de una actividad enzimática........................................................................ 187
7.4.. Elección de vectores de expresión............................................................................................. 190
7.5.. La tecnología Gateway.................................................................................................................... 193
8 142 problemas de Ingeniería Genética resueltos paso a paso
7.6.. Clonación de un dominio de homología a Pleckstrina..................................................... 195
7.7.. La proteína B3KPS6......................................................................................................................... 198
7.8.. La proteína Nck1 en el vector pET-Min.................................................................................. 203
7.9.. Sustitución de una resistencia a antibiótico por otra......................................................... 206
7.10.. Caracterización de la tiorredoxina como proteína de fusión......................................... 208
7.11.. Expresión de una fosfatidilinositol 3-quinasa en pEF1-Myc/His............................... 211
7.12.. Inserción de secuencias Kozak por PCR ................................................................................ 213
7.13.. Clonación en el vector pET23...................................................................................................... 214
8. SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ............................................................................. 225
8.1.. Caracterización de algunas enzimas modificadoras del DNA...................................... 226
8.2.. Secuenciación de un inserto en pBluescript-SK.................................................................. 228
8.3.. Determinación de la secuencia de un rRNA 16S................................................................ 229
8.4.. Determinación de SNP.................................................................................................................... 231
8.5.. Secuenciación masiva...................................................................................................................... 233
8.6.. Secuenciación de un fragmento de DNA clonado en el plásmido pCTO................ 234
8.7.. Determinación de la secuencia en un vector pUC19 por el método Sanger.......... 236
8.8.. Diagnóstico genético de la enfermedad de Huntington................................................... 238
8.9.. Comprobación de la orientación de un DNA pasajero..................................................... 239
8.10.. Secuenciación de variantes del gen VEGF ............................................................................ 241
8.11.. Determinación del punto de inicio transcripcional ............................................................ 243
8.12.. Secuenciación de un fragmento de DNA y clonación en pBluescript ...................... 245
8.13.. Detección de mutaciones en p53 ................................................................................................ 247
8.14.. Estudios de unión al factor represor CRE.............................................................................. 249
8.15.. Actividad anómala de un retrotransposón estudiada por RNA-Seq............................ 250
8.16.. Traducción de una secuencia C-terminal clonada en pEGFP....................................... 251
8.17.. Secuenciación de un gen de una cadena de dineína .......................................................... 253
8.18.. Secuenciación del plásmido pTacTac....................................................................................... 258
9. EDICIÓN Y SILENCIAMIENTO GÉNICO....................................................................................... 261
9.1.. Utilización de siRNA o de shRNA............................................................................................ 261
9.2.. Estudio de regulación del promotor IV del gen BDNF.................................................... 263
9.3.. Control de la expresión de un gen por silenciamiento ..................................................... 264
9.4.. Estudios de regulación de la huntingtina................................................................................ 265
9.5.. Estudio del efecto de fármacos sobre el factor de supervivencia celular................ 267
9.6.. Diseño de dos secuencias de siRNA......................................................................................... 269
9.7.. Diseño de un shRNA........................................................................................................................ 274
9.8.. Estudio de funcionalidad de la telomerasa reversa humana (hTERT)...................... 276
9.9.. Localización de motivos PAM en una secuencia................................................................ 277
9.10.. Edición génica en Saccharomyces cerevisiae....................................................................... 280
Índice 9
10.. BIOLOGÍA DE SISTEMAS E INGENIERÍA METABÓLICA................................................ 289
10.1.. Modelización de un sistema metabólico................................................................................. 289
10.2.. Modelización de un sistema metabólico en un clúster bacteriano.............................. 292
10.3.. Ligación del cDNA de una hidroxilasa en el vector pBact-UCM............................... 293
10.4.. Inserción del gen de la hidroxilasa en una cepa de Escherichia.................................. 296
10.5.. Producción de acetoína en levadura.......................................................................................... 300
10.6.. Obtención de citramalato en E. coli.......................................................................................... 302
10.7.. Producción de 1,4-butanodiol a partir de glucosa en E. coli......................................... 305
11.. EJERCICIOS COMBINADOS.................................................................................................................. 309
11.1.. El neuropéptido Y.............................................................................................................................. 309
11.2.. Clonación en el vector pET23...................................................................................................... 313
11.3.. Clonación de la calmodulina ........................................................................................................ 323
11.4.. Expresión del dominio intracelular de la glicoforina fusionado a la GST.............. 328
11.5.. Caracterización del dominio intracelular de la neurexina .............................................. 332
11.6.. Fusión de la proteína de adhesiones focales Cten a la GFP........................................... 337